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鈣離子成像
光遺傳學(xué)應(yīng)用以及成果不僅得益于其核心技 術(shù) ( 微生物視蛋白變體、視蛋白靶向策略、光靶向裝置 ) 的發(fā)展，也得益于與輔助技術(shù)的整合，涉及電生理學(xué)、神經(jīng)元活動成像等數(shù)據(jù)讀取，這樣的整合方式賦予了光遺傳學(xué)在不同時間尺度、不同空間尺度上發(fā)揮功能的優(yōu)勢。
近年來，鈣離子成像與熒光顯微技術(shù)作為新興的腦活動呈現(xiàn)技術(shù)得到了快速發(fā)展。神經(jīng)元鈣離子成像是目前腦功能研究中觀察神經(jīng)元以及神經(jīng)環(huán)路活動監(jiān)測的Z常用手段之一。其原理是神經(jīng)元激活伴隨著鈣離子進入細胞，與鈣離子指示劑結(jié)合會出現(xiàn)熒光強度的改變，從而體現(xiàn)神經(jīng)活動變化，對神經(jīng)活動可進行長達數(shù)月的監(jiān)測，實現(xiàn)長期體內(nèi)神經(jīng)元成像。鈣離子指示劑是目前Z常用的基因編輯熒光指示劑，來自于綠色熒光蛋白 (green fluorescent protein，GFP) 或其變異體、鈣調(diào)蛋白 (calmodulin， CaM)、肌球蛋白輕鏈激酶 M13 域的融合，其中鈣指示劑 GCaMP6 由于*的敏感度，廣泛應(yīng)用于在體成像研究中。光遺傳集成顯微系統(tǒng)，整合了光遺傳學(xué)與鈣成像技術(shù)，利用單光子成像技術(shù)，使用 LED作為光源，將梯度折射率透鏡 (gradient refractive index，GRIN) 作為物鏡。這種集成顯微鏡可以在自由活動的老鼠中實現(xiàn)高速大規(guī)?？v向記錄特定神經(jīng)元群體的鈣離子動態(tài)，從而反映神經(jīng)元與神經(jīng)環(huán)路的活動情況。
新一代光遺傳學(xué)技術(shù)達到了目前研究所需要的高時間、空間、細胞類型分辨率，具備單個神經(jīng)元與神經(jīng)纖維分辨率的神經(jīng)元群體的長期監(jiān)測能力 ( 表 1) 。
自由活動神經(jīng)元超微鈣離子成像系統(tǒng) nVista 和 結(jié)合光遺傳自由活動神經(jīng)元超微鈣離子成像系統(tǒng)nVoke 是目前Z先進的光遺傳集成顯微系統(tǒng)，在神經(jīng)環(huán)路疾病的研究上具有很大的優(yōu)勢。上述集成系統(tǒng)能夠整合光遺傳學(xué)調(diào)控和實時鈣離子成像，通過微型植入式探頭，在自由活動的動物上長期觀察特定神經(jīng)元群體與腦環(huán)路的神經(jīng)活動，可以實現(xiàn)自動聚焦、精準(zhǔn)定位任意目標(biāo)區(qū)域、無需手工調(diào)整，最終將同時段的行為學(xué)記錄、電生理信息、鈣離子成像等進行多模態(tài)整合，對于參與特定腦疾病神經(jīng)環(huán)路中的細胞進行解析，繪制環(huán)路細胞類型與功能圖譜，解釋特定腦疾病的潛在發(fā)病機制。
功能和用途
1、功能：本儀器是基于多模光纖的微弱熒光信號檢測和記錄系統(tǒng)，能夠穩(wěn)長時間穩(wěn)定的激發(fā)綠色熒光，并檢測熒光信號的微弱變換。
2、用途：用于在體記錄動物群體神經(jīng)元活動鈣信號的動態(tài)變化，主要用途和特點如下：
通過光學(xué)記錄通過遺傳手段所確定的特定細胞類型在自然狀態(tài)下的神經(jīng)活動；
實時觀測動物在進行復(fù)雜行為時的神經(jīng)投射活動；
闡明特殊的神經(jīng)環(huán)路在動物行為中的作用；
檢測新型可遺傳編碼的乙酰膽堿和多巴胺等探針的熒光變化，即可實時監(jiān)測乙酰膽堿、多巴胺等濃度的動態(tài)變化情況；
通過直接觀測和投射相關(guān)的活動從而在根本上了解以前不可能接觸到的神經(jīng)環(huán)路的動態(tài)行為；
光遺傳學(xué)技術(shù)的應(yīng)用
光遺傳學(xué)技術(shù)可以實現(xiàn)在神經(jīng)元的快速精準(zhǔn)控制以及數(shù)據(jù)讀取，極大程度上促進了神經(jīng)科學(xué)發(fā)展， 幫助業(yè)內(nèi)學(xué)者了解更復(fù)雜的神經(jīng)過程(如學(xué)習(xí)、睡眠、視覺、成癮、運動，等 )，對于腦疾病中神經(jīng)環(huán)路的解析具有重要意義，并且有望用于尋找各種神經(jīng)疾病治療的新靶點。
腦疾病神經(jīng)環(huán)路研究 神經(jīng)環(huán)路是由一系列相聯(lián)系的神經(jīng)元構(gòu)成的具有明確功能的神經(jīng)元之間的纖維聯(lián)系，是大腦神經(jīng)系統(tǒng)的基本單元。對于腦疾病的理解可以來自于多個層面，從細胞分子水平的微觀水平到動物行為的宏觀水平，前期的研究主要集中在微觀細胞分子水平與宏觀動物行為水平。以神經(jīng)環(huán)路為基礎(chǔ)的腦功能連接組圖譜，對于理解腦功能意義重大，要提高對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的認識，目前急需的是識別潛在的神經(jīng)環(huán)路的異常。腦疾病如阿爾茨海默病 (Alzheimer’s disease，AD)、帕金森病 (Parkinson’s disease，PD)、亨廷頓病 (Huntington’s disease，HD)、癲 等所發(fā)生的病理生理變化會影響 正常神經(jīng)環(huán)路的功能，產(chǎn)生相應(yīng)的臨床癥狀，了解其神經(jīng)環(huán)路的異常變化是理解疾病發(fā)生發(fā)展機制以及尋找相應(yīng)治療方案的必經(jīng)途徑 。
AD
AD是老年人中最常見的慢性神經(jīng)退行性疾病，進行性記憶衰退是疾病特征，患者隨后認 知損害更廣泛，顯著受影響的是學(xué)習(xí)與記憶神經(jīng)環(huán)路。目前，海馬區(qū)域的神經(jīng)環(huán)路以及其與前額葉皮質(zhì)區(qū)相互聯(lián)系是被廣泛研究的腦區(qū)域。海馬結(jié)構(gòu)與前額葉皮質(zhì)以雙向方式相互作用，調(diào)節(jié)多種認知功能以及處理情緒信息，是大腦記憶系統(tǒng)中極為重要的結(jié)構(gòu)，有助于新信息的快速編碼、記憶網(wǎng)絡(luò)的整合、檢索與組織。
發(fā)作性記憶進行性喪失是 AD 早期的常見癥狀，大腦中記憶儲存在一群特定神經(jīng)元 —— 海馬印跡細胞中。AD 早期的記憶衰退的機制并不明確，可能是信息編碼與整合或是存儲與檢索神經(jīng)環(huán)路受損。利用新一代光遺傳學(xué)技術(shù)，研究人員發(fā)現(xiàn)印跡細胞傾向于通過重復(fù)性活動以同步、協(xié)調(diào)的方式進行工作，不同群體的印跡細胞組成不同類型的同步性活動呈現(xiàn)記憶( 圖 3)。通過對 AD 早期轉(zhuǎn)基因小鼠海馬區(qū)印跡與非印跡細胞進行長時間的區(qū)分、監(jiān)測和調(diào)控，發(fā)現(xiàn)激活海馬印跡細胞可以促使記憶恢復(fù)，說明 AD記憶損傷是由于記憶檢索提取相關(guān)神經(jīng)環(huán)路受損所致，而不是記憶存儲的損傷所致。
利用 AD 小鼠模型，研究人員發(fā)現(xiàn)在 AD 典型病理變化 β 淀粉樣斑塊沉積產(chǎn)生之前，小鼠的遺忘呈現(xiàn)出年齡依賴性，與海馬齒狀回的棘突密度有關(guān)。利用新一代光遺傳學(xué)技術(shù)長期刺激齒狀回神經(jīng)元，通過誘導(dǎo)齒狀回印跡細胞產(chǎn)生長時程增強，促進棘突密度以及長期記憶的恢復(fù)，并且去除這部分印跡細胞可以阻止長期記憶的恢復(fù)，提示 AD 早期選擇性的挽救恢復(fù)印跡細胞的棘突密度可能是治療記憶喪失的有效靶點。
PD
PD 是一種神經(jīng)退行性疾病，中腦黑質(zhì)致密部和腹側(cè)被蓋區(qū)的多巴胺能神經(jīng)元逐漸死亡是 其病理特征。PD 的主要癥狀是運動障礙，包括靜止性震顫、肌肉僵硬和運動無力。典型發(fā)病機制是紋狀體功能失調(diào)，直接與間接通路功能失衡所致 ( 圖4)。涉及的主要神經(jīng)元為中間棘狀神經(jīng)元 (medium spiny neuron，MSN)，主要表達多巴胺 D1 和 D2 兩種受體。光遺傳學(xué)研究提供了紋狀體 MSN、中間神經(jīng)元和傳入神經(jīng)元的詳細信息，從而對于 PD 的基 本病理做出了解析。光遺傳學(xué)在 PD 的運動功能、多巴胺能神經(jīng)元移植、病理環(huán)路研究上得到較多應(yīng)用，特別是 PD 環(huán)路功能失調(diào)，是目前的研究熱門領(lǐng)域，近年獲得了眾多進展 ( 表 2)。
癲 癲
是一種由于神經(jīng)元高興奮性引起的神經(jīng)環(huán)路興奮性異常增高，從而出現(xiàn)癲 發(fā)作為特征的疾病。以往用于解析癲 神經(jīng)環(huán)路異常的方法包括藥物刺激和光刺激釋放，這些方法受限于時間分辨率低以及谷氨酸補給。研究人員利用光遺傳技術(shù)的高時間與空間分辨率對以往存在質(zhì)疑的失神發(fā)作環(huán)路進行了研究，發(fā)現(xiàn)丘腦皮質(zhì)神經(jīng)元的節(jié)律同步性腦電波發(fā)放以及階段性發(fā)放，對誘發(fā)失神發(fā)作中的同步尖峰放電波以及行為是必需且充分的。癲 發(fā)作嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量，造成患者認知損害和記憶損傷，前期研究認為可能與海馬長期暴露于異常高鈣離子濃度下造成的損傷有關(guān)。常規(guī)技術(shù)無法在哺乳類動物海馬神經(jīng)元觀察其鈣動力學(xué)，利用新一代光遺傳學(xué)技術(shù)，研究人員發(fā)現(xiàn)不僅在癲發(fā)作期間，而且在癲 發(fā)作出現(xiàn)以及 EEG 異常之前，海馬神經(jīng)元的鈣動力學(xué)就出現(xiàn)了明顯異常，這種異常發(fā)現(xiàn)可以促使研究者抓住癲 發(fā)作前的時機從而控制癲 發(fā)作。海馬神經(jīng)元內(nèi)的鈣離子水平顯著高于正常水平，提示鈣興奮性細胞毒性可能是癲 致認知損害的原因。有趣的是常規(guī)抗癲 藥物丙戊酸鈉并未改變在癲 中所觀察到的鈣離子動力學(xué)的異常。未來可以利用大規(guī)模的神經(jīng)元鈣離子成像平臺進行新的抗癲藥物篩選，為癲 治療提供新視角。
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