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重復(fù)經(jīng)顱磁刺激結(jié)合穿梭箱訓(xùn)練對腦梗死恢復(fù)期大鼠 認(rèn)知功能的影響
目的：比較重復(fù)經(jīng)顱磁刺激(repetitive transcranial magnetic sti腿lation，rTMS)單獨或與穿梭箱訓(xùn)練結(jié)合對短暫性 大腦中動脈閉塞(transient middle cerebral artery occlusion,tMCAO)大鼠恢復(fù)期認(rèn)知功能的影響。
方法:60只雄性SD大鼠經(jīng)tMCAO術(shù)后，根據(jù)神經(jīng)功能評分分為5組:rTMS刺激組(n=7)、訓(xùn)練組(n=8)、rTMS結(jié)合 訓(xùn)練組(n=7)、對照組(n=7)、假手術(shù)組(n=6)，于術(shù)后7天開始進(jìn)行20Hz rTMS和/或穿梭箱訓(xùn)練，術(shù)后第1、7、14、 21、28天進(jìn)行改良神經(jīng)功能缺陷程度評分(mNSS )術(shù)后第28天進(jìn)行Morris水迷宮實驗。
結(jié)果：第28天時rTMS結(jié)合訓(xùn)練組(P<0.001)與rTMS刺激組(P<0.05)的mNSS評分均低于對照組。水迷宮實驗第
1 一5天訓(xùn)練組及對照組平均逃避潛伏期較假手術(shù)長(P<0.05)，第3天rTMS結(jié)合訓(xùn)練組的平均逃避潛伏期較rTMS 組及訓(xùn)練組短CP<0.05)。對照組穿越平臺次數(shù)較假手術(shù)組少(P<0.05)，rTMS結(jié)合訓(xùn)練組穿越平臺次數(shù)較rTMS 組、訓(xùn)練組及對照組多(P<0.05)。
結(jié)論:rTMS結(jié)合穿梭箱訓(xùn)練可以改善腦梗死恢復(fù)期大鼠的認(rèn)知功能，效果優(yōu)于單一的rTMS刺激或訓(xùn)練。
關(guān)鍵詞重復(fù)經(jīng)顱磁刺激;短暫性大腦中動脈閉塞;恢復(fù)期;認(rèn)知功能
我國每年新發(fā)的腦卒中病例超過240萬，其中 腦梗死患者占76%[|_2]，腦梗死常導(dǎo)致運動功能和進(jìn) 行性認(rèn)知功能等障礙。研究表明[3]，30%以上的腦卒 中患者在發(fā)病3個月內(nèi)出現(xiàn)認(rèn)知障礙，與無認(rèn)知障 礙的患者相比，存在認(rèn)知障礙的患者在其他受損功 能的恢復(fù)上也受到嚴(yán)重影響，但目前針對腦卒中后 認(rèn)知功能障礙(post- stroke cognitive impairment, PSCI)的治療手段仍有限。重復(fù)經(jīng)顱磁刺激(repeti-tive transcranial magnetic stimulation, rTMS)是一■ 種非侵人性的神經(jīng)刺激技術(shù)，其作用在刺激結(jié)束后 可維持1—2h，已被逐漸用于PSCI的治療'目前 臨床上有rTMS聯(lián)合認(rèn)知功能訓(xùn)練改善腦卒中患者 認(rèn)知功能的研究[5]，但其作用機(jī)制尚不明確。本研 究假設(shè)，rTMS結(jié)合即刻認(rèn)知功能訓(xùn)練對認(rèn)知功能 的改善具有易化作用，效果優(yōu)于單獨的刺激或訓(xùn) 練。為此，本研究比較了重復(fù)經(jīng)顱磁刺激與認(rèn)知功 能訓(xùn)練單一治療或聯(lián)合治療對短暫性大腦中動脈閉 塞（transient middle cerebral artery occlusion, tM- CAO)大鼠恢復(fù)期認(rèn)知功能的影響，為rTMS臨床應(yīng) 用方案提供理論依據(jù)，為進(jìn)一步研究機(jī)制打下基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1實驗材料
1.1.1實驗動物：SPF級雄性SD大鼠60只，體重 240—260g，由廣東省中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提 供，許可證號：SCXK(粵)2013-0034,所有動物均飼 養(yǎng)于中山大學(xué)(生命科學(xué)學(xué)院中藥與海洋藥物實驗 室）SPF級實驗環(huán)境中，許可證號：SYXK(粵)2014- 0020，采用已消毒顆粒型大鼠飼料喂養(yǎng)，飲用消毒滅 菌水，環(huán)境溫度控制在20—25°C。
1.1.2主要儀器與試劑：XR-XC105型水迷宮視頻 分析系統(tǒng)（上海欣軟信息科技有限公司），CCY-I型 磁場刺激儀（武漢依瑞德醫(yī)療設(shè)備新技術(shù)有限公 司），XR-XC105型穿梭實驗視頻分析系統(tǒng)(Shuttle- box system) (上海欣 軟信息 科技有 限公司)
3討論
作為近年來新興的非侵人性腦刺激技術(shù)，rTMS 已被廣泛應(yīng)用于多種疾病的診斷和治療，如抑郁癥、 腦卒中、帕金森病等[|4-|6]，臨床上也逐漸將rTMS作
為PSCI的治療手段之」17]。[卩等[18]的研究表明， rTMS能改善腦卒中患者的認(rèn)知和記憶功能，且治 療效果持續(xù)2個月。另外，在基礎(chǔ)實驗研究方面， Guo等[4]對SD大鼠的tMCAO模型進(jìn)行10Hz的rT-MS 干預(yù) ，并用水迷宮實驗檢測認(rèn)知功能 ，發(fā)現(xiàn) rT-MS 組大鼠的認(rèn)知功能較對照組有顯著改善。
目前關(guān)于rTMS干預(yù)腦梗死后認(rèn)知功能障礙的 動物實驗研究多數(shù)集中于腦梗死后急性期(24h后) 且干預(yù)時間較短，一般不超過7 — 14天[10州。然而在 臨床上，將rTMS應(yīng)用于急性期腦卒中患者通常是 不可行的。此外，一般認(rèn)為受損大腦在急性期非常 容易受到過度激發(fā)[20一21], Risedal等[22]使用大腦中動 脈閉塞大鼠模型的研究表明，急性期(大腦中動脈閉 塞后24h)的訓(xùn)練增加了組織損傷，延遲訓(xùn)練（閉塞 后7天)能獲得更好的效果，說明腦卒中急性期應(yīng)用 rTMS可能是不利的。我們既往研究表明，腦梗死 后恢復(fù)期28—56天的大鼠始終存在認(rèn)知功能障 礙[23]。本研究對tMCAO術(shù)后7天的大鼠進(jìn)行較長 時間的rTMS干預(yù)，并觀察對恢復(fù)期認(rèn)知功能障礙 的影響，為本研究的一個創(chuàng)新點，為臨床上腦梗死恢 復(fù)期患者認(rèn)知障礙的rTMS治療提供了實驗依據(jù)。
在臨床的實際應(yīng)用中有時會將rTMS與傳統(tǒng)的 常規(guī)治療相結(jié)合。有研究表明rTMS刺激18名健康 受試者的M1或S1可以加強(qiáng)對側(cè)手臂運動任務(wù)的訓(xùn) 練效果，增強(qiáng)感覺運動能力的學(xué)習(xí)，表明rTMS可以 改變皮層興奮性，從而有可能增強(qiáng)后續(xù)的訓(xùn)練和學(xué) 習(xí)效果[24]。劉遠(yuǎn)文等[25]對腦卒中患者試驗組左側(cè)前 額葉背外側(cè)區(qū)（DLPFC)予以10Hz rTMS刺激及認(rèn) 知功能訓(xùn)練，對照組僅給予認(rèn)知功能訓(xùn)練，結(jié)果表明 高頻rTMS聯(lián)合認(rèn)知功能訓(xùn)練可以改善腦卒中患者 的執(zhí)行功能障礙，且療效優(yōu)于單一的認(rèn)知功能訓(xùn) 練。目前尚未有rTMS結(jié)合其他訓(xùn)練干預(yù)腦梗死后 認(rèn)知功能障礙的動物實驗研究。本研究將缺血 90min后再灌注的大鼠tMCAO模型作為干預(yù)對象 進(jìn)行rTMS及訓(xùn)練處理，為本實驗的另一創(chuàng)新點，也 為深人研究機(jī)制打下基礎(chǔ)。
穿梭箱訓(xùn)練是一種雙向主動回避(two-way ac-tive avoidance, TWAA) 訓(xùn)練，通常用 于檢測 動物的 學(xué)習(xí)記記憶能力及執(zhí)行決策能力。動物在剛開始接 觸電刺激時明顯處于應(yīng)激狀態(tài)，Stark等[26]研究發(fā)
現(xiàn)，動物在應(yīng)激狀態(tài)下受到的壓力本身并不能決定 其規(guī)避策略的形成。有研究表明，對海馬(尤其是海 馬腹側(cè))活動的短暫抑制會干擾主動回避的學(xué)習(xí)[27]， 海馬區(qū)主要是處理學(xué)習(xí)、記憶等與認(rèn)知功能有關(guān)任 務(wù)的區(qū)域，表明TWAA訓(xùn)練可能與認(rèn)知功能存在密 切關(guān)系。動物在受到非條件刺激時逃向安全區(qū)，同 時學(xué)習(xí)與條件刺激的關(guān)聯(lián)，并逐漸形成主動條件反 射，是一個不斷強(qiáng)化學(xué)習(xí)記憶的過程。本研究中將 穿梭箱訓(xùn)練作為認(rèn)知功能訓(xùn)練，也是本研究創(chuàng)新點 之1'。
研究提示，腦的狀態(tài)依賴性(brain state depen-dent) 是決定 rTMS 誘導(dǎo)腦可塑性改變的一個關(guān)鍵因 素[28-29]。Jung等[3。]發(fā)現(xiàn)，興奮性或抑制性磁刺激后 即刻進(jìn)行訓(xùn)練，均可強(qiáng)化運動學(xué)習(xí)，符合非穩(wěn)態(tài)可塑 性理論(non-homeostatic plasticity)。本研究表明， rTMS后即刻進(jìn)行穿梭箱認(rèn)知訓(xùn)練對認(rèn)知功能改善 效果較單獨rTMS治療及單獨認(rèn)知訓(xùn)練好，與臨床 研究結(jié)果一致[25]。
20Hz的高頻rTMS作用于患側(cè)大腦半球，可引 起長時程增強(qiáng)的作用，產(chǎn)生提高皮層興奮性的后效， 這一機(jī)制可能與雙向突觸可塑性的（bienenstock- cooper-munro，BCM)理論有關(guān)，該理論的一個基本
原理是突觸的近期活動情況影響其當(dāng)前的反應(yīng)水 平[31]。本實驗中高頻rTMS可能是通過改變突觸可 塑性，提高皮層興奮性，加強(qiáng)后續(xù)認(rèn)知功能訓(xùn)練的效 果。有研究發(fā)現(xiàn)，TMS可以促進(jìn)更廣泛的樹突和軸 突分枝，上調(diào)軸突出芽標(biāo)志物GAP-43的表達(dá)[32]。同 時TMS磁刺激區(qū)域附近的白質(zhì)完整性較刺激前有 提高[33_34]，有研究表明，白質(zhì)損傷在腦血管病致認(rèn)知 功能損害中起重要作用[35]，打皿8可能促進(jìn)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) 結(jié)構(gòu)的修復(fù)。
本實驗初步驗證了rTMS結(jié)合穿梭箱訓(xùn)練對腦 梗死恢復(fù)期大鼠認(rèn)知功能改善效果較單獨rTMS治 療及單獨訓(xùn)練好，但未能在多個時間點動態(tài)觀察大 鼠認(rèn)知功能改善的情況，尚未能深人探討相關(guān)機(jī) 制。本研究提示臨床上對于腦梗死后認(rèn)知障礙的患 者，可在rTMS刺激后立即對患者進(jìn)行認(rèn)知功能訓(xùn) 練，對于患者的康復(fù)可能更加有效。我們下一步擬 對rTMS與其他訓(xùn)練相結(jié)合對腦梗死恢復(fù)期認(rèn)知功 能影響的機(jī)制進(jìn)行深人探討。
