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摘要：目的探討丙泊酣對(duì)眶額葉皮層興奮性及相關(guān)學(xué)習(xí)記憶功能的影響。方法采用神經(jīng)藥理學(xué)方法在眶額葉皮層微注射丙泊酣，檢 測(cè)大鼠在T -迷宮中的反轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)記憶功能及開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中運(yùn)動(dòng)、情緒和探索動(dòng)機(jī)的變化；通過(guò)免疫組化檢測(cè)c -fos表達(dá),觀測(cè)丙泊酣對(duì) 眶額葉皮層神經(jīng)元興奮性的影響。結(jié)果眶額葉皮層微注射丙泊酣后，大鼠在T-迷宮中的學(xué)習(xí)記憶能力下降（P< 0.05);開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中 眶額葉微注射丙泊酣未影響大鼠的運(yùn)功、情緒及探索能力（P >0.05);丙泊酣可顯著抑制眶額葉皮層c-fos表達(dá)。結(jié)論丙泊酣可直接 抑制眶額葉皮層神經(jīng)元的活動(dòng)，引起學(xué)習(xí)記憶能力下調(diào)，表明眶額葉皮層是丙泊酣發(fā)揮麻醉效應(yīng)的重要靶區(qū)。
關(guān)鍵詞：丙泊酣；眶額葉皮層；反轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)記憶;認(rèn)知功能；大鼠
丙泊酚是臨床常用靜脈麻醉藥物[1-3]。研究表明， 丙泊酚麻醉后受試者不能維持覺(jué)醒，表現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶和 決策等認(rèn)知功能下調(diào)[4-6]。目前，丙泊酚麻醉如何下調(diào) 學(xué)習(xí)記憶功能的神經(jīng)機(jī)制尚不*清楚。有研究表明， 丙泊酚可直接作用于學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的海馬和內(nèi)嗅皮層 腦區(qū)。在海馬區(qū)，丙泊酚可抑制神經(jīng)元興奮性，降低突觸 傳遞效率和可塑性，并抑制乙酰膽堿遞質(zhì)釋放[7-11];同 時(shí)，下調(diào)內(nèi)嗅皮層神經(jīng)元的活動(dòng)[12]。眶額葉皮層興奮性 與覺(jué)醒程度密切相關(guān)，并對(duì)學(xué)習(xí)記憶、決策及執(zhí)行功能 起重要作用。在靈長(zhǎng)類和嚙齒類動(dòng)物中，損毀眶額葉皮層 可損害動(dòng)物的反轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)記憶功能和認(rèn)知的靈活性[13 -16]。 采用正電子計(jì)算機(jī)斷層（PET)技術(shù)監(jiān)測(cè)人腦活動(dòng)，發(fā)現(xiàn) 丙泊酚麻醉使眶額葉皮層活動(dòng)下降,而對(duì)其他新皮 層作用較小[17],提示眶額葉與丙泊酚麻醉密切相關(guān)。本 研究中通過(guò)神經(jīng)藥理學(xué)、免疫組化及行為學(xué)檢測(cè)方法， 探討在眶額葉皮層微注射丙泊酚對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能及神 經(jīng)元活動(dòng)的影響，以期進(jìn)_步闡明丙泊酚麻醉效應(yīng)，特 別是麻醉中認(rèn)知下調(diào)的神經(jīng)機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。
1材料與方法 1.1材料
動(dòng)物與分組:健康雄性SD大鼠26只,2個(gè)月月齡, 清潔級(jí)，體質(zhì)量250 ~ 300 g,雄性，購(gòu)于陸junjun醫(yī)大學(xué)動(dòng) 物中心，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(渝）-PLA-20160011, 實(shí)驗(yàn)操作符合陸junjun醫(yī)大學(xué)動(dòng)物倫理規(guī)范。行為實(shí)驗(yàn) 中，共使用26只大鼠：14只大鼠隨機(jī)分為2組（溶劑對(duì) 照組和丙泊酚處理組，各7只，用于T -迷宮實(shí)驗(yàn)監(jiān)測(cè) 反轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)記憶；12只大鼠隨機(jī)分為2組（溶劑對(duì)照組和 丙泊酚處理組，各6只，用于開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。
試藥：丙泊酚（批號(hào)為56931,分析純，純度& 98%),多聚甲醛（批號(hào)為16005,純度>98%),4',6- 二脒基-2 -苯基吲哚（DAPI),批號(hào)為D9542,純度& 98%),均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；c-fos免疫組化染色的 —抗（批號(hào)為ab208942)和二抗（批號(hào)為ab150113)均購(gòu) 于英國(guó)Abcam公司。
儀器：IVM - 1000型微量注射泵（英國(guó) T-迷宮行為檢測(cè)裝置及配套動(dòng)物軌跡視頻追蹤系統(tǒng)， 開(kāi)場(chǎng)行為檢測(cè)設(shè)備及配套動(dòng)物軌跡視頻追蹤系統(tǒng)（中國(guó) 上海欣軟信息科技公司）；CM 1900型冰凍切片機(jī)(德國(guó) Leica ;腦立體定位儀（中國(guó)深圳瑞沃德公司）。
1.2. 1埋置給藥導(dǎo)管及微量給藥
將大鼠用3%戊巴bi妥鈉進(jìn)行麻醉（每100 g體質(zhì) 量0. 25 mL,腹腔注射），置腦立體定位儀，用酒精和碘 伏消毒后，剪開(kāi)顱骨表面皮膚及去除軟組織，暴露顱骨。 用過(guò)氧化氫擦拭顱骨表面，暴露前囟和后囟點(diǎn)。明確眶 額葉額葉皮層定位坐標(biāo)(anteroposterior: + 3. 7 mm, mid-dle - lateral. ± 2. 5 mm, dorsoventral. - 4. 0 mm) 。 根據(jù)上 述坐標(biāo)，用牙科鉆制作下導(dǎo)管的骨孔，在骨孔周圍安裝 固定螺絲，完成后用微推將導(dǎo)管（中國(guó)深圳瑞沃德公司） 埋植于眶額葉皮層。用牙科水泥將固定螺絲和導(dǎo)管固 定。手術(shù)完成后，將大鼠置飼養(yǎng)籠恢復(fù)，恢復(fù)5 ~7d后 進(jìn)行T-迷宮或開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。
采用微量注射泵進(jìn)行微量給藥，在眶額葉給藥體積 為0.5 pL,丙泊酚的濃度為50pmol/L[12，18]。微量給藥 速度為每2 min 0. 5 pL,給約完成后留針2 min,使約物擴(kuò) 散。給藥后15 min進(jìn)行T -迷宮或開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。
限食：訓(xùn)練前4 d進(jìn)行食物攝取限制（每天給予大 鼠約10 ~ 15 g食物)，使大鼠體質(zhì)量降至85%。
環(huán)境適應(yīng)：在動(dòng)物進(jìn)行限食過(guò)程中，同時(shí)讓大鼠在 T迷宮中適應(yīng)，讓動(dòng)物在撒有食物粒的T -迷宮中自由 探索 8 ~ 10 min。
T-迷宮測(cè)試:T-迷宮主要由1個(gè)中心臂及2個(gè)選擇 臂構(gòu)成(各臂長(zhǎng)50 cm,寬20 cm)。共訓(xùn)練10 d，前6 d將 食物固定于T -迷宮的左側(cè)，每天進(jìn)行10次訓(xùn)練，每次 間隔30 s。訓(xùn)練時(shí)讓大鼠從中央臂的起點(diǎn)出發(fā)到左右的 選擇臂尋找食物（放于選擇臂末端）。訓(xùn)練6 d后，將食 物放于T -迷宮的右側(cè)，繼續(xù)訓(xùn)練4 d。每次訓(xùn)練前，眶 額葉皮層給予溶劑或丙泊酚，給藥15 min后進(jìn)行訓(xùn)練。 動(dòng)物若能準(zhǔn)確找到食物，記錄1次正確的選擇;反之，則 記錄為1次錯(cuò)誤的選擇。
開(kāi)場(chǎng)為1 mx1 mx1 m的盒子（開(kāi)口、黑色）。每只
大鼠僅接受1次測(cè)試，測(cè)試前15 min在眶額葉皮層給 藥。大鼠放于入開(kāi)場(chǎng)的中心區(qū)域，自由探索5 min。利用 視頻追蹤系統(tǒng)檢測(cè)大鼠在開(kāi)場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)距離、站立次 數(shù)、進(jìn)入中心區(qū)域的次數(shù)及距離。
完成行為檢測(cè)后，采用生理鹽水(37 °C) +4%多聚 甲醛(4 癈 )進(jìn)行灌注和固定。灌注固定后取腦組織。大 腦在4%多聚甲醛中固定，完成后轉(zhuǎn)移至30%蔗糖+ 4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行脫水。腦組織沉底后，進(jìn)行冰凍 切片（厚度40 pm)。按冠狀面對(duì)眶額葉皮層連續(xù)切片， 對(duì)切片進(jìn)行DAPI染色。完成后進(jìn)行封片，在熒光顯微 鏡下檢測(cè)導(dǎo)管埋置位置是否位于眶額葉皮層。導(dǎo)管埋置 不準(zhǔn)大鼠不納入統(tǒng)計(jì)。
按照1. 2. 1項(xiàng)下方法操作，在眶額葉皮層微量注射 溶劑和丙泊酚。為排除眶額葉皮層自身晝夜節(jié)律影響， 注射溶劑和丙泊酚在固定時(shí)間點(diǎn)(19:00)。完成注射90min 后，按照1.2.4項(xiàng)下方法進(jìn)行灌注固定。將腦組織置 4%多聚甲醛外固定過(guò)夜，30 %蔗糖[磷酸緩沖鹽溶液 (PBS)配置]脫水過(guò)夜。切片30 pm,PBS中保存。一抗染 色，濃度 1 : 200, 4 C 24 h,室溫 2 h, PBS 漂洗 10 min, 共3次。DAPI染色5 min, 1 xPBS漂洗10 min 1次，二抗 避光染色，濃度為1 : 200, 2 h, 1 X PBS漂洗10 min 3次。貼片后80%甘油封片，顯微鏡下觀察眶額葉皮層 c - fos的表達(dá)。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
采用SPSS 18. 0和Sigma Plot軟件分析。計(jì)量資料 用X± s表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P< 0.05為差異 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1引起大鼠反轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)能力受損
采用T -迷宮檢測(cè)大鼠反轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)記憶能力（圖1 A)。 前6 d,將食物固定于T -迷宮的左側(cè)臂，隨著訓(xùn)練的 天數(shù)增加，大鼠在T-迷宮中選擇正確率亦逐漸增加； 第6天，兩組動(dòng)物選擇的正確率均達(dá)到80% (圖1 B); 隨后，檢測(cè)大鼠反轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)記憶能力，在眶額葉皮層給藥 后，大鼠在反轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)過(guò)程中選擇正確率顯著低于對(duì)照組 動(dòng)物（圖1 B),表明丙泊酚可作用于眶額葉皮層損害大 鼠的反轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)記憶能力。
2.2 對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)、探索動(dòng)機(jī)和情緒行為無(wú)明顯效應(yīng) 反轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)也可能受到非特異性因素的干預(yù),如情緒 和探索動(dòng)機(jī)?？纛~葉皮層微注射丙泊酚對(duì)大鼠在開(kāi)場(chǎng)中 的運(yùn)動(dòng)距離和站立次數(shù)無(wú)明顯效應(yīng)（圖2 A至圖2 C), 表明丙泊酚在眶額葉皮層并不影響大鼠的運(yùn)動(dòng)功能和 探索行為。同時(shí)，眶額葉皮層給予丙泊酚不影響大鼠進(jìn)入開(kāi)場(chǎng)中心區(qū)域的次數(shù)和運(yùn)動(dòng)距離（圖2D至圖2 E)， 可直接作用于
表明大鼠的焦慮情緒行為未受到影響。 眶額葉皮層，通 本欄目由
2.3 可降低眶額葉皮層神經(jīng)元的興奮性 過(guò)抑制該腦區(qū)宙八=1
采用免疫組化檢測(cè)c - fos蛋白表達(dá),分析給藥后眶活動(dòng)進(jìn)而下調(diào) 額葉皮層神經(jīng)元興奮性的變化。給藥后眶額葉皮層熒光 學(xué)習(xí)記憶功能， 協(xié)辦
信號(hào)較弱，且c-fos陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量顯著減少（圖3)， 表明眶額葉皮
表明丙泊酚可直接抑制眶額葉皮層神經(jīng)元的興奮性。
3 討論
丙泊酚麻醉導(dǎo)致覺(jué)醒不能維持，表現(xiàn)為認(rèn)知功能嚴(yán) 重下調(diào)。在眶額葉局部微注射丙泊酚引起大鼠在T-迷 宮中的正確選擇率嚴(yán)重下降；開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，眶額葉皮層 微注射丙泊酚對(duì)大鼠的運(yùn)動(dòng)、情緒和探索動(dòng)機(jī)無(wú)明顯效 應(yīng)，可引起c -fos陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量減少。結(jié)果表明，丙泊 酚可直接抑制眶額葉皮層興奮性，引起警覺(jué)及認(rèn)知功能 下調(diào)。
眶額葉皮層主要接受體感皮層、背縫核、邊緣皮層 和海馬的輸入，主要投射至前額葉和腹側(cè)被蓋區(qū)[19-21]。 靈長(zhǎng)類動(dòng)物中，損毀眶額葉皮層動(dòng)物在學(xué)習(xí)記憶任務(wù)中 選擇的錯(cuò)誤次數(shù)增多。嚙齒類動(dòng)物中，抑制或損毀眶額 葉皮層可造成反轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)記憶或認(rèn)知的靈活性受損 反轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)與眶額葉皮層神經(jīng)元放電編碼模式和神經(jīng)元 集群網(wǎng)絡(luò)振蕩密切相關(guān)。采用多通道記錄技術(shù)監(jiān)測(cè)眶額 葉皮層神經(jīng)元的放電，發(fā)現(xiàn)在反轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)過(guò)程中，眶額葉 皮層神經(jīng)元放電能表征環(huán)境信號(hào)所預(yù)測(cè)的結(jié)果[23 -24]。 通過(guò)c - fos標(biāo)記技術(shù)發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可能是通過(guò)下調(diào)眶額 葉皮層的神經(jīng)元興奮，抑制神經(jīng)元的特定編碼模式，進(jìn) 而造成反轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)功能受損。
在新皮層及皮層下區(qū)域，丙泊酚可直接作用于神經(jīng) 元的胞體，增強(qiáng)神經(jīng)元的鉀通道或抑制超極化激活非選 擇性陽(yáng)離子通道，產(chǎn)生外向電流，導(dǎo)致神經(jīng)元發(fā)生超極 化，引起興奮性下降。丙泊酚同時(shí)可增強(qiáng)GABAA型受體 介導(dǎo)的抑制性輸入，間接地抑制神經(jīng)元活動(dòng)[12,8,5-27]。但 本研究側(cè)重于行為學(xué)和形態(tài)學(xué)的觀察，丙泊酚調(diào)控眶額 葉皮層的離子通道機(jī)制尚不清楚，還需進(jìn)一步研究。
丙泊酚作為常用麻醉藥物，具有起效快、蘇醒快的 特點(diǎn)，其麻醉的顯著特征為認(rèn)知功能下調(diào)[4-5]。丙泊酚
